страница - 0
Лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода во время фотодинамических реакций
Рябова А.В. (Nastya R V@rambler.ru) Стратонников А.А., Лощенов В.Б., Конов В.И.
Центр естественно-научных исследований Института общей физики
им. А.М. Прохорова РАН
Введение
Основным механизмом разрушающего действия фотосенсибилизаторов (ФС), используемых в настоящее время для фотодинамической терапии1, является реакция II типа генерации синглетного кислорода2. Синглетный кислород в биологических системах может претерпевать тушение двумя способами3 - физическим, в этом случае энергия возбужденного состояния передается тепловым колебаниям окружающих молекул, и химическим, при котором синлентный кислород вступает в химические реакции (прежде всего окисления) с окружающими биомолекулами. В резултате химического тушения происходит утилизация синглетного кислорода. В результате химического тушения синглетного кислорода может образовываться также перекись водорода4, - активный радикал, также способный вызывать необратимые изменения биомолекул, но, в отличие от синглетного кислорода, обладающий большим временем жизни и, соответственно, большим радиусом разрушающего действия. Недостаточная эффективность фотодинамической терапии часто обусловлена плохим накоплением ФС непосредственно в опухолевых клетках, в то время как в подводящем сосудистом русле концентрация ФС может быть высокой56. Проникновение перекиси водорода вглубь опухоли может решить эту проблему, однако, до сих пор вопрос количественного образования перекиси водорода при лазерном облучении с ФС не был изучен. Нами предложен лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода во время фотодинамических реакций. Метод позволяет с большой точностью определить скорость образования перекиси водорода в средах, содержащих различные биогенные элементы и фотосенсибилизаторы во время лазерного облучения.
Флуоресцентная сенсорная система количественного определения образования перекиси водорода
№ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин (коммерческое названием Amplex RedTM, Molecular Probes; далее, феноксазин) широко используется в биохимических исследованиях для детекции перекиси водорода. В присутствии пероксидазы он реагирует с перекисью водорода, образуя сильно флуоресцирующий краситель - резоруфин, при этом также образуется одна молекула кислорода (рис. 1а)78.
длина волны (нм)
б
Рисунок 1. а - Реакция перехода феноксазина в резоруфин при ферментативном расщеплении перекиси водорода пероксидазой. б - Спектры флуоресценции и поглощения резоруфина.
Спектры поглощения и флуоресценции резоруфина приведены на рисунке 1б.
Максимумы поглощения и флуоресценции имеют место на 571 и 586 нм, соответственно.
Коэффициент экстинкции резоруфина в водном растворе составляет 60 000 М1 см-1.
Экспериментальная установка
Для регистрации перекиси водорода в реальном масштабе времени, в том числе при воздействии светового облучения с контролируемой плотностью мощности, была разработана следующая установка (рис. 2).
Исследуемый раствор помещался в стандартную кварцевую кювету толщиной 2 мм. Объем образца составлял 2х10х10 мм3. Далее кювету поворачивали в горизонтальное положение и помещали на предметное стекло. Под действием капиллярных сил исследуемый раствор не выливался из кюветы, лишь поверхность раздела приобретала небольшую кривизну.
Для возбуждения флуоресценции резоруфина использовался лазер с длиной волны 532 нм и мощностью 10 мВт. Свет от лазера доставлялся к образцу с помощью кварцевого волокна диаметром 200 мкм. Флуоресценция собиралась с помощью такого же волокна, расположенного в непосредственном контакте с доставляющим волокном. Оба волокна располагались под углом 45 градусов по отношению к поверхности образца, а их торцы находились в 1 мм от поверхности образца. При такой геометрии поперечный размер области зондирования составлял порядка 1 мм, а продольный размер - всю толщину образца. На расстоянии 4 см от поверхности образца размещался торец волокна, по которому подводилось мощное лазерное излучение (1 Вт, 675 нм). Диаметр пятна на поверхности образца составлял 1.6 см, так чтобы весь образец подвергался лазерному воздействию.
Рисунок 2. Схема экспериментальной установки для регистрации перекиси водорода в реальном масштабе времени при лазерном облучении.
При такой геометрии эксперимента зондируемое волокно занимало фиксированное
положение относительно образца. Для определения абсолютной концентрации резоруфина
проводили калибровку интенсивности флуоресценции при известной концентрации резоруфина
в образце. Толщина образца 2 мм была выбрана исходя из того, чтобы при больших
концентрациях резоруфина уменьшить влияние эффекта перепоглощения флуоресценции.
Кроме того, при такой толщине можно еще не учитывать неоднородность света от
терапевтического лазера по глубине при используемых концентрациях красителей до 5 мкМ.
Интенсивность зондирующего лазера выбиралась таким образом, чтобы с одной стороны
обеспечить достаточную чувствительность при детектировании резоруфина, а с другой стороны,
чтобы эффекты фотодеструкции от этого лазера были минимальны. Это было
проконтролировано путем смещения образца на несколько миллиметров в сторону и
содержание:
[стр.Введение] [стр.1] [стр.2] [стр.3]